分子生物學資料庫專論: 2014

2014年12月22日星期一

尋找miRNA target sites

這次上課介紹了真核生物才有的抑制基因表現系統-micro RNA(miRNA)。利用miRNA一些特性(例如大小迴文序列有stem loop等)可以預測特定基因上可能被miRNA辨識的位置。

1. 此次操作隨機選了人類miRNA編號18中的hsa-mir-18a-5p來當作主角，並透過http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.php網站來搜尋人類可被hsa-mir-18a-5p target的基因。

2. 老師再從中隨機指派一個能被hsa-mir-18a-5p target基因-PTEN，反過來我們可再由另一網站https://cm.jefferson.edu/rna22v2.0/來線上預測此基因可能的miRNA target sites。

2-1 進入頁面後，進入網站選擇HOMO SAPIENS，在最下面一欄直接打上欲搜尋的基因名"PTEN"，並按下subunit搜尋。

2-2 搜尋後會進入一頁面，再按下View Predictions as cDNA map。

2-3 之後會挑出一個新頁面，紅色box就是此基因被預測能與不同miRNA結合的序列，點開choose location/miF可在對應的序列位置找到可能會辨認此位置的miRNA(可有多種，但有些未經證實)。

2-4 尋找hsa-mir-18a-5p在PTEN基因辨認序列。回到2-2圖示頁面，並按下View Predictions as Table搜尋，即可以table的方式得到所有能target PTEN基因的miRNA，可直接利用Ctrl + F搜尋hsa-mir-18a-5p，可發現此miRNA所辨認的序列位置在8037bp。

2-5 回到2-3圖示頁面直接尋找8037bp位置，按下相對應choose location鍵，即可發現hsa-mir-18a-5p此miRNA確實能辨認PTEN基因序列，完成此次作業。

2014年12月10日星期三

Small Molecular Interaction I- 利用VMD軟體模擬蛋白與水分子間的交互作用

這次上課介紹一個新軟體"VMD"，跟PyMol軟體很像，可探討及分析蛋白質的結構。
第一堂課的作業即是自己找一個已被解結構的蛋白，並用VMD軟體模擬此蛋白如何與水分子進行交互作用。

1. 利用RCSB網站 http://www.rcsb.org去搜尋有興趣且被解結構的蛋白。
我找了一個自己實驗中所分析的蛋白Leucine-responsive regulatory protein (Lrp)，但是我所研究的細菌Vibrio vulnificus的Lrp尚未被分析結構，但在E.coli中Lrp已被研究很多，包含結構的部分。
搜尋結果如下圖，可知道此Lrp的結構代碼為2GQQ。

2. 打開VMD軟體，開啟蛋白的結構圖。
打開軟體後，在File選項中選擇New molecule，並在filename中輸入利用RCSB網站找到的蛋白結構代碼2GQQ，按下Load鍵稍等片刻即會顯示蛋白結構圖，圖中是三D空間可用滑鼠左右上下翻轉蛋白結構，也可用滑鼠滾輪向前zoom in或向後zoom out，下載此結構檔案(File->Save Visualization State-->存檔)。

3. 改變蛋白結構的顯示。
在Graphics選項中，點選representation會跑出一個視窗，在Drawing Method選項挑選Newcartoon (原本為Line)，按下Apply按鍵即可改變蛋白結構的顯示方式。

4. 建立psf檔。
從Extensions選項點選Modelling -> Automatic PSF Builder，直接按下左下角I'm feelinf lucky按鍵，等待片刻會跳出一個視窗，按下確定鍵及建立好psf檔案，結構圖會有稍微不同。

5. 加入水分子至蛋白結構圖周圍。

在Extensions選項點選Modelling -> Solvation Box，會跳出一個視窗，勾選裡面Rotate to minimize volume，並在Box size X,Y,Z欄都填入15 A(0.1 nm)，按下下方Solvate鍵，即完成water box。

2014年11月18日星期二

利用STRING來預測蛋白與蛋白之間的交互作用

STRING是一個線上網路工具http://string-db.org/，可以用來分析或預測protein-protein interaction。
此網站所分析的結果是根據文獻而整理出來的，利用點與線的關係來呈現目標蛋白與其他蛋白之間的關係。

進入網站後可在首頁上輸入欲分析的蛋白，這裡以Leucine-responsive regulatory protein(Lrp)為例。

搜尋之後，會發現有許多細菌的Lrp都有被研究過(會以A~Z排列)，包含文獻最大宗的E.coli、

Salmonella。

點選Vibrio vulnificus YJ016，按下網頁最下面的Continue進行預測。

進入新頁面後，即可看到點與線的圖，中間的點為Lrp，周圍是其他跟Lrp相關的蛋白，線代表有直接的關係。由於Vibrio vulnificus YJ016有關Lrp的文獻不多，只有顯示與10個蛋白有直接的關係。

下面有這10個蛋白的全名及胺基酸長度，也有圖示說明上圖的symbol(包含線的顏色)。

這些與Lrp相關的蛋白包含一些與胺基酸代謝的蛋白、膜上運輸蛋白、有關tRNA synthetase及細胞分裂的蛋白，再次證明Lrp是一個能調控很多基因的蛋白。可點開特定蛋白，會顯示蛋白結構、胺基酸序列及一些簡單的蛋白資訊。

按下網頁下面Textmining鍵也可進一步了解這些結果的文獻出處及摘要，了解實驗的內容。

2014年11月5日星期三

建立物種親緣關係 by Phylogenetic Tree (Part II)

接續上次進度，這次要利用上禮拜所下載下來的10個胺基酸序列做出親緣關係樹圖

操作流程圖:

1. 打開phylip-3.69中的exe資料夾，將上次存取的檔案取消附檔名(.phy)，並改成infile檔名，方便待會程式辨認而開啟。

2. 打開seqboot程式，若上述檔案格式及檔名正確會呈現下圖所示:

輸入指令: R --> enter --> Numbers of replicates --> 200 --> Y --> enter --> Random number seed --> 1

輸入完指令，會得到outfile檔案，將原本infile檔名改成其他名稱，並再將outfile改成infile檔名，方便下個程式開啟。

3. 打開protdist程式，若上述有將檔名弄對就可以成功開啟程式，如下圖所示

輸入指令: M --> enter --> multiple data sets (type D) --> How many data sets --> 200 --> Y

輸入完指令，等待系統作業，之後會得到另一個outfile，將上個infile檔名改成其他名稱，並再將剛到的outfile改成infile檔名，方便下個程式開啟。

4.打開neighbor程式，若上述檔案名稱都改正確就可以成功開啟此程式，如下圖

輸入指令: M --> enter --> How many data sets --> 200 --> Random number seed --> 1 --> Y

輸入完指令，等待系統作業，之後會得到outfile及outtree兩個檔。

5. 以記事本打開 "outfile" 可察看詳細資料，如下圖。並將之前infile及outfile檔名都改掉且outtree檔名改成intree，後續程序才能讀取此檔案。

6. 開啟consense程式，若成功開啟會呈現下圖所示。輸入Y之後程式會產生 "outfile" 及 "outtree" 兩個檔案，以記事本打開 "outfile" 可察看詳細資料。

7. 開啟另一程式TreeViewX，並開啟剛剛建立的outtree檔，即可得到親緣關係樹圖。

建立物種親緣關係 by Phylogenetic Tree (Part I)

利用NCBI BLAST線上分析工具 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 來搜尋與目標基因相似的序列。我們以Vibrio vulnificus的leucine-responsive regulatory protein(Lrp)來當做此次目標基因，來搜尋相似序列並在下次建立親緣關係。

1. 進入BLAST網站，並點選nucleotide blast。

2. 貼上部分V. vulnificus的leucine-responsive regulatory protein(Lrp) gene序列(61~180)。

3. 在Program Selection選擇 More dissimilar sequences (discontiguous megablast)，可搜尋較多的相似序列，按下BLAST選項，等待系統作業時間。

4. BLAST之後，系統會跑出序列相似的基因及哪一物種所擁有，其中包含我們的V. vulnificus YJ016 strain (序列比對為100%符合)及其他V. vulnificus strains (99%相似)及其他系統顯示的結果會依序遞減基因相似性。

5. 在左邊勾選10個帶有lrp相似基因序列的菌株，並下載各個基因序列(GeneBank)。
以BioEdit開啟10個基因序列 --> 點選Accessory Application--> ClustalW Multiple Alignment --> RunClustal
--> 完成基因alignment -->